实验流程实验流程分为三步,建立谱图库、DIA数据采集、DIA数据定量分析。 1.使用胰蛋白酶对各个样本相同的蛋白量进行酶解,酶解后的肽段混合物中加入稳定重同位素标记的肽段,使用LC-MS/MS以及DDA数据采集模式对其进行分析,检测得到的结果使用软件进行检索分析。软件根据MS2谱图的信息,并结合经典的正反库搜库策略对MS2谱图进行解析,并得到肽段鉴定结果,进而得到蛋白质鉴定结果,将该鉴定结果构建为谱图库; 2.随后各个样本进样相同量的蛋白酶解后的肽段进入LC-MS/MS进行检测,使用DIA采集策略对各个样本进行数据采集; 3.使用DIA数据处理软件,根据样本中掺入的稳定重同位素标记肽段的色谱保留时间对各个样本鉴定到的谱图信息进行保留时间校正,然后根据谱图库中蛋白质鉴定到的多肽信息在DIA数据中进行定量离子信号抽提,统计其色谱峰面积,最后对各个样本间的蛋白质丰度进行比较。------------------------------------------------样品要求1.各个样本蛋白质总量在100ug以上;2. 样本来源:体液样本,组织样本,植物样本,微生物样本。。。3.溶液样本须告知详细的溶液组成; 4.请使用足量的干冰运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。------------------------------------------------交付结果1.实验流程; 2.前处理基本方法; 3.LC-MS/MS参数; 4.蛋白质定性、定量结果列表; 5.差异蛋白筛选列表; 6.生物信息学分析:GO注释,KEGG通路分析、蛋白质相互作用网络图分析。
实验流程1.各个样品首先分别进行等量酶切;2.每一个酶切得到的肽段样品选择一种标记试剂进行标记反应(每一个肽段至少含有一个游离的氨基进行反应);3.将经过不同标记的肽段样品混合后进行后续的质谱分析。来自不同样品的同一肽段经iTRAQ试剂标记后具有相同的质量数,并在一级质谱检测(MS1)中表现为同一个质谱峰。当此质谱峰被选定进行碎裂后,在二级质谱检测(MS2)中,不同的报告基团被释放,它们各自的质谱峰的信号强弱,代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低;4.检测得到的结果使用软件进行检索分析。软件根据MS2谱图的信息,并结合经典的正反库搜库策略对MS2谱图进行解析,得到肽段鉴定结果,进而得到蛋白质鉴定结果,同时软件还对各个蛋白质的特征性肽段的报告离子强度信息进行统计,以报告离子强度作为肽段的丰度表征,进而得出蛋白质的丰度值,最终得到样本间蛋白质的相对丰度比值。 ------------------------------------------------样品要求1.各个样本蛋白质总量在100ug以上;2.样本来源:体液样本,组织样本,植物样本,微生物样本。。。3.溶液样本须告知详细的溶液组成; 4.如自行酶解蛋白样本需详细沟通酶解过程; 5.请使用足量的干冰运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。------------------------------------------------交付结果1.实验流程; 2.前处理基本方法; 3.LC-MS/MS参数; 4.蛋白质定性、定量结果列表; 5.差异蛋白筛选列表; 6.生物信息学分析:GO注释,KEGG通路分析、蛋白质相互作用网络图分析。
实验流程1.使用胰蛋白酶对各个样本的蛋白质进行酶解;2.酶解后的肽段混合物在高效纳升液相色谱上进行分离,并使用超高分辨率质谱仪对其进行检测;3.检测得到的结果使用软件进行检索分析。软件根据MS2谱图的信息,并结合经典的正反库搜库策略对MS2谱图进行解析,得到肽段鉴定结果,进而得到蛋白质鉴定结果,同时软件还对各个蛋白质的特征性肽段的峰面积进行统计,以色谱峰面积作为肽段的丰度表征,进而得出蛋白质的丰度值,最终得到样本间蛋白质的相对丰度比值。------------------------------------------------样品要求1.各个样本蛋白质总量在100ug以上;2.样本来源:体液样本,组织样本,植物样本,微生物样本,多肽组学样本。。。3.溶液样本须告知详细的溶液组成;4.请使用足量的干冰运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性;5.建议进行生物学重复分析。------------------------------------------------交付结果1.实验流程;2.前处理基本方法;3.LC-MS/MS参数;4.蛋白质定性、定量结果列表;5.差异蛋白筛选列表;6.差异蛋白生物信息学分析:GO注释,KEGG通路分析、蛋白质相互作用网络图分析等。
实验流程1.使用蛋白酶将蛋白质酶切为肽段混合物;2.使用在线联用的LC-MS对多肽进行分离与检测,液相选择纳升液相色谱,质谱选择超高分辨率质谱仪;3.使用检索软件根据MS2谱图信息与数据库进行比对,并使用国际主流的正反库搜库策略对假阳性结果进行过滤,最后得到可靠的肽段鉴定结果,进而得到蛋白质鉴定结果。同时对每个蛋白质鉴定到的特征性肽段色谱峰峰面积进行统计,以色谱峰面积作为蛋白质的丰度表征,进而对阳性样本与阴性样本蛋白质的丰度进行比较,丰度比值为1的,为非特异性结合蛋白,阳性样本中丰度显著高于阴性样本的为真实的可靠的互作蛋白。------------------------------------------------样品要求1.银染、考染的样本不需要脱色;2.样本低温寄送;3.溶液样本须告知溶液组成;4.溶液样本需告知蛋白总量;5.跑胶的样本在制备时必须佩带手套、口罩、帽子、白大褂以避免自身角蛋白的污染;6.使用阴性对照样本去除假阳性鉴定结果的实验,整个实验必须保证阳性与阴性样本前处理IP、富集等条件完全一致。------------------------------------------------交付结果1.括实验流程;2.前处理基本方法3.LC-MS/MS参数4.蛋白质鉴定结果列表与定量结果