实验服务
一、液体配制：硼酸硼砂缓冲液：0.05M四硼化钠45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4；胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡盐液定容至100ml。所用的培养板、培养瓶或玻片预先经100μg/L多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干备用。二、操作步骤：1、出生 2 d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。2、在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。3、随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液（DMEM＋10％FBS）的离心管内终止消化液作用5min。4、用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10％FBS的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。5、将所收集的上清经200目筛网过滤。6、过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液（DMEM＋20％FBS）并吹打成单细胞悬液。7、细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内，放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。三、无菌操作注意事项：细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。四、服务流程：收费标准欢迎询价详谈更多实验技术服务请见中心*，或来电询洽！ 做实验，找威斯腾！【本平台合作项目】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物学类，蛋白组学类，细胞生物学类，芯片类，病理类实验技术服务，并可以为科研朋友提供课题设计指导，SCI翻译润色。威斯腾生物/整体外包/课题设计指导/整体实验
一、细胞操作方法1、将切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中（可不要动它），在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室；2、在超净台中将标本放入培养皿中，加入α-MEM洗涤；3、获得组织切开，仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织，附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织（可作另一管消化），仔细剔除脂肪组织，用α-MEM洗二次（以去除红细胞），放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎4、用双倍获得组织的体积含有4mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM消化37℃孵育120分钟（在此期间震动混匀数次）；5、30分钟后收集第一管细胞：细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟，上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织，继续用于消化；6、离心管底细胞用α-MEM离心洗涤2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转，离心6分钟，最后一次用记数板观察到有细胞。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接种到培养瓶中培养。7、60钟后收集第二管细胞：细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转离心6分钟，最后一次用记数板观察细胞并计数。细胞最终悬浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接种到培养瓶中培养。8、必要时可做第三管细胞收集；并立即作原代滑膜细胞培养。9、每2-3天换液一次。二、无菌操作注意事项细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。 做实验，找威斯腾！【本平台合作项目】分子诊断、病理诊断、药效学评价、毒理学实验、细胞药筛、动物建模、PDX模型、CRISPR/Cas9基因编辑、病理检测、基因芯片、蛋白组学、代谢组学、高通量测序、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！【全国免费热线】：400-675-6758【电话】 023-65316016,023-65316556【邮箱】 china-western@163.com【官网网址】www.cqwestern.com【地址】 重庆市高新区二郎创业大道高科创业园 D 栋 2 楼
一、实验动物SD大鼠，2周龄，若干，购于第三军医大学实验动物中心。二、主要仪器及试剂1、主要仪器设备电热压力蒸汽消毒灭菌锅(XDD) （浙江绍兴医疗器械总厂）超净工作台 （苏州净化设备公司）生物安全柜 （上海博讯实业有限公司） TC2323型CO2恒温细胞孵箱 （美国SHEL LAB 公司）电热恒温鼓风干燥箱 （上海跃进医疗器械厂）高速台式离心机(BACKMAN CS-15R) （美国Beckman公司）0.22um除菌滤器 （德国BM公司）恒温循环水浴锅 （Pharmacia公司生产）迷你型超速离心机 （德国Eppendorf公司生产）微型高速冷冻离心机 （德国Eppendorf公司生产）1/10000电子天枰(Sartorius AC-211) （德国）细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) （美国）各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管 （美国Axygen公司）细胞计数板 （上海医用仪器厂）微量移液器 （德国Eppendorf公司）光学显微镜(OLYMPUS) （日本）倒置显微镜（OLYMPUS) （日本）照像系统(OLYMPUS) （日本）小型台式离心机（TGL-16G，中国）电子分析天平（Precisa12A，瑞士）电热恒温水浴箱（DK-8D，中国）2、 主要试剂 DMEM-F12培养基 （GIBCO，美国）胎牛血清 （GIBCO，美国）胰蛋白酶青/链霉素溶液（100X） （Beyotime，中国） （Beyotime，中国）DMSO （Amresco，公司） PBS （中山，北京）台盼蓝粉末 （Sigma，美国）淋巴细胞分离液 （TBD）3、 主要试剂配制 (1)PBS：用购自中山公司的PBS粉剂，每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，高压灭菌消毒。三、 实验步骤 1、细胞生长培养基的制备培养基在使用前需加入10%的胎牛血清和双抗，一般为血清。培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 按细胞生长需求，制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL。 2、大鼠骨髓间充质干细胞的分离（1）取SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。（3）从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞。（4）缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。（5）2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨髓基质细胞层（白色浑浊状），PBS洗三次。（6）用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以106/mL的细胞浓度接种于625px2培养瓶中，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。（7）24小时后弃去培养液（看细胞贴壁情况），PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合。（8）经0.25%胰酶消化，1：2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。四、细胞形态观察骨髓间充质细胞原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。五、无菌操作注意事项细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。 做实验，找威斯腾！【本平台合作项目】分子诊断、病理诊断、药效学评价、毒理学实验、细胞药筛、动物建模、PDX模型、CRISPR/Cas9基因编辑、病理检测、基因芯片、蛋白组学、代谢组学、高通量测序、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！【全国免费热线】：400-675-6758【电话】 023-65316016,023-65316556【邮箱】 china-western@163.com【官网网址】www.cqwestern.com【地址】 重庆市高新区二郎创业大道高科创业园 D 栋 2 楼
一、实验动物 新生24h 内清洁级C57小鼠若干，客户提供。二、主要仪器及试剂1、主要实验仪器80/150/200目不锈钢细胞筛上海生工，中国电热压力蒸汽消毒器浙江绍兴医疗器械总厂超净工作台苏州净化设备公司二氧化碳培养箱三洋（Sanyo），日本电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂低速台式离心机上海安亭科学仪器厂倒置显微镜 OLYMPUS，日本照像系统OLYMPUS，日本移液器Eppendorf，德国细胞计数板上海医用仪器厂细胞培养瓶及细胞培养板Costar，美国各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管 Axygen，美国0.22um纤维素滤膜 MILLIPORE，美国0.45um混合纤维素滤膜 MILLIPORE，美国剪刀、镊子中山恒基达医疗器械2、主要试剂B27 Gibco，美国DMEM-F12培养基Gibco，美国Neurobasal A medium Gibco，美国胎牛血清Gibco，美国胰蛋白酶碧云天，中国PBS北京中杉青霉素-链霉素溶液（100X）碧云天，中国DMSOAmresco，美国L-多聚赖氨酸 sigma，美国阿糖胞苷（Ara-C）Pharmacia，美国L-谷氨酰胺 Gibco，美国台盼蓝Sigma，美国多聚甲醛国药集团Aβ42客户提供3、主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min高压灭菌，44℃冰箱保存。（2）接种液的配制：按胎牛血清与DMEM-F12培养液体积比1：10，无菌条件下加入1%体积分数的双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。（3）神经细胞维持培养液（无血清培养液）的制备 ：Neurobasal；2%B-27；1% 0.5mmol/L L-谷氨酰胺；1%青链霉素。换液前 3h 配制，置于4℃备用。（4）0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量 10mg L-多聚赖氨酸，溶于 100ml 灭菌去离子水，0.22μm 正压滤器过滤分装，-20℃保存。 （5）阿糖胞苷溶液的制备： a. Ara-C 储存液：称量 Ara-C 0.01g，溶于25mL去离子水中，即成 1.4mmol/L储备液。0.22μm 正压滤器过滤分装，置-20℃冰箱储存。 b. Ara-C 工作液： Ara-C储存液与无血清培养基以1:3 体积比配制成浓度为100µg/mL 的溶液。使用时按照培养液与100µg/mL的Ara-C体积比40:1 稀释，即Ara-C的工作浓度为2.5µg/mL。 （6）0.4%台盼蓝溶液的配制：台盼蓝4 g，PBS少许（研磨），PBS定容至100mL，滤纸过滤，室温保存。 （7）4%多聚甲醛的配制：多聚甲醛4g，PBS 100mL加热至 60℃，边滴加1mol/L NaOH边搅拌，至液体澄清。 （8）四噻唑兰溶液配制：MTT50mg，PBS10mL磁力搅拌30min，0.22µm 微孔滤膜过滤分装，4℃保存，2周有效。 三、细胞操作实验方法1、小鼠海马神经元细胞的原代分离培养（1）培养板的包被用0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养板和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。 吸弃 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。 2、小鼠海马神经元细胞的分离及培养 （1）75%（体积分数）酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠，在无菌条件下脱颈处死，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。（2）无菌分离海马组织。保持脑组织背面朝上，在镜下小心翻开大脑皮质，暴露海马，用眼科剪或尖镊分离海马周围组织，取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。（3）用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2~3 次。（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗2次。巴斯德吸管轻轻吹打 20次，制成细胞悬液，静置 2min。（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000rpm，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或 100µL/孔接种 96 孔培养板。（7）置 37℃、5%CO2培养箱培养 4-6h，全量更换为无血清培养液。（8）体外培养第3d，加入Ara-C-工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。（9）此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7～21d的细胞用于实验。四、无菌操作注意事项细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。 做实验，找威斯腾！【本平台合作项目】分子诊断、病理诊断、药效学评价、毒理学实验、细胞药筛、动物建模、PDX模型、CRISPR/Cas9基因编辑、病理检测、基因芯片、蛋白组学、代谢组学、高通量测序、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！【全国免费热线】：400-675-6758【电话】 023-65316016,023-65316556【邮箱】 china-western@163.com【官网网址】www.cqwestern.com【地址】 重庆市高新区二郎创业大道高科创业园 D 栋 2 楼
一、实验动物 清洁级SD大鼠乳鼠，若干，购于第三军医大学动物实验中心二、主要仪器及试剂1、主要实验仪器80/150/200目不锈钢细胞筛（上海生工，中国）小型台式离心机(TGL-16G，中国)电子分析天平(Precisa12A，瑞士)千分之一电子天平(GB303 Mettler-Toledo Instr. Ltd)移液器（eppendorf，德国）电热恒温水浴箱(DK-8D，中国)旋涡振荡器(QL-901，中国)光学倒置显微镜(Olympus AX70，日本)隔水式电热恒温培养箱(XMTH-142，中国)细胞培养箱(Shellab，美国)超净工作台（VS-1300，中国苏州）纯水仪高压灭菌锅台式水浴恒温振荡摇床 SHZ-8 0.22um纤维素滤膜 0.45um混合纤维素滤膜细胞培养瓶及细胞培养板细胞计数板 （MILLIPORE，德国）（上海赛洋，中国）（江苏太仓市实验设备厂，中国）（BM，德国）（BM，德国）（Costar，美国）（上海医用仪器厂，中国）2、主要试剂 DMEM-F12培养基 （Gibco，美国）胰蛋白酶 （Beyotime，美国）PBS （ 中山，北京）胎牛血清 （Gibco，美国）青霉素 （华北制药厂，中国）链霉素 （华北制药厂，中国）3、主要试剂配制(1)PBS：用购自中山公司的PBS粉剂，每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，高压灭菌消毒。(2) 0.25%胰蛋白酶消化液：使用时浓度为0.25%，含0.02%EDTA，制备时即取250mg胰酶和20mgEDTA溶于100mLPBS溶液，并在无菌操作台上用0.22um一次性过滤器过滤，50ml分装，4℃保存。(3) DMEM-F12细胞生长培养液：临用前根据需要加10%胎牛血清，1%的ITS，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL，置于4℃冰箱保存。(4)抗生素：青霉素(80万U)和链霉素(100万U)在无菌操作台内以高压灭菌过的双蒸水溶解(分别加入4ml灭菌水/青霉素，5ml灭菌水/链霉素)，配制成20万u/ml分装，置于-20℃冰箱保存，临用时4℃解冻，注意尽量避免反复冻融，并使培养基最终浓度为100 u/ml。(5)细胞冻存液：生长培养基（含20%胎牛血清）或100%胎牛血清，加入10%的DMSO混合均匀，置于4℃冰箱保存。三、细胞操作实验方法1、细胞生长培养基的制备培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和双抗，一般为10%~20%血清。培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 按细胞生长需求，制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清+1%ITS，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL。2、大鼠心肌成纤维细胞原代分离培养（1）将SD乳鼠在75%酒精中浸泡1-5min，然后固定在泡沫板上，先用碘酒消毒胸腹部，再用酒精消毒。取出无菌剪刀和镊子，先用酒精棉球再次消毒，剪开胸，取心尖部位，快速置于含双抗的预冷的PBS溶液润洗3遍。（2）剔除周围结缔组织，将心脏置于无菌平皿中，将心脏尽量剪碎，平皿内加入适量0.125%的胰酶，在37度培养箱中，采用分次消化，每次消化5分钟，一共消化8~10次。（3）每次消化后取上清液，并加入等量的含10%的DMEM/F12培养基，轻轻混匀，中和胰酶的消化，防止消化多度。用100目细胞过滤筛子过滤含细胞的混合液，最后将过滤后的细胞悬液1000R/MIN离心5分钟。离心后收集沉淀，用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬。于细胞培养瓶中培养。（4）在培养90分钟左右，将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞，加入DMEM/F12培养基，放入培养瓶继续培养。（5）24h换液，并每日观察心肌成纤维细胞的生长。四、无菌操作注意事项细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。 做实验，找威斯腾！【本平台合作项目】分子诊断、病理诊断、药效学评价、毒理学实验、细胞药筛、动物建模、PDX模型、CRISPR/Cas9基因编辑、病理检测、基因芯片、蛋白组学、代谢组学、高通量测序、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！【全国免费热线】：400-675-6758【电话】 023-65316016,023-65316556【邮箱】 china-western@163.com【官网网址】www.cqwestern.com【地址】 重庆市高新区二郎创业大道高科创业园 D 栋 2 楼