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小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型

      缺血再灌注损伤(IRI)是器官移植、休克、动脉搭桥术后等普遍存在的问题。肾脏是发生IRI极为常见的器官之一，尤其肾移植，不可避免的要经历一定程度的IRI,肾脏缺血再灌损伤是急性肾衰的常见原因。对麻醉动物的肾动脉进行阻断和再通后，可引起肾脏缺血再灌注损伤。在缺血再灌注过程中，钙超载、线粒体能量合成障碍、氧自由基的增多等因素导致肾小管内皮细胞脱落，肾脏组织结构的破坏进而使肾脏功能发生障碍。

1.实验动物
 SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。

2.实验分组
  实验分组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组，每组15只动物。

3.模型周期
  24h、72h

4.建模方法
  4.1 选取20-22g左右小鼠，术前禁食12h，自由饮水。
  4.2 3％戊BA比妥钠(80mg／kg)腹腔注射麻醉,小鼠背部去毛，消毒备皮。 
  4.3 在背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏, 小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 
  4.4 缺血45min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 
  4.5 分两层缝合开口,待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。
  4.6 对照组不做缺血处理，其他操作相同。
  4.7 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。

5.模型的评价
  5.1 血清生化指标检测： 
  取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。
  5.2 肾系数检测
  摘取双侧肾脏后，生理盐水冲洗，称重计算肾系数。
  肾系数=双侧肾重（mg）/体重（g）
  5.3 病理组织学检测
  4％多聚甲醛溶液固定48h。常规组织脱水、透明、浸蜡 、包埋。石蜡切片进行HE染色和PAS染色。
对照组小鼠肾小球、 肾小管及肾间质结构基本正常。在 模型组组， 随着再灌注时间的延长呈现不同程度的肾脏病理改变， 可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，出现水样或空泡变性，刷状缘消失，部分肾小管上皮细胞凝固性坏死、脱落，腔内可见管型，并可见间质水肿，间质内灶性炎症细胞浸润，肾小球病变不明显。每张切片×200 倍镜下取外髓质部 10 个视野，按 
    0 = 正常，
    1 = 轻微损伤(受损肾小管< 5%)，
    2= 轻度损伤(受损肾小管 5 %～25 %)，
    3 = 中度损伤(受损肾小管 25 %～75 %)，
    4 = 重度损伤(受损肾小管> 75 %) 作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数
  5.4 细胞因子的检测
  ELISA 法检测血清 TNF-α、IL-6 含量, 模型组小鼠血清 TNF- α 和 IL- 6 含量在各时间点均显著高于对照组，其中24h为最显著。

6.注意事项
  6.1 分离肾脏时不要损伤肾脏及其他器官
  6.2 缺血要一次成功否则会造成缺血预处理而减轻损伤
  6.3 缺血和应可见肾脏先变白一段时间后变暗发紫

图1 小鼠肾脏缺血再灌注手术操作图（动脉夹夹闭两侧肾动脉，缺血45min后松开动脉夹）