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小鼠明矾OVA致哮喘模型

  哮喘是一种由多种炎症细胞及炎症介质参与的气道慢性炎症性疾病，气道炎症、平滑肌功能紊乱和气道重塑是哮喘的主要病理改变，发病率呈逐年增加趋势。
  现已发现有多种细胞因子参与哮喘发病的调控，其中关于Th1/Th2类细胞因子失衡学说为目前的研究热点。IFN-γ、IL-4分别是Th2、Th2细胞的特征性细胞因子，在哮喘的发病机制中，IFN-γ和IL-4的不平衡是引起IgE产生异常和哮喘发病的重要因素，调节Th1细胞因子活性或抑制Th2细胞因子已成为哮喘防治探讨的新热点。最新的研究发现在抗原刺激后气道上皮可以使前炎性细胞因子 IL-25 表达增加，促使 IL-4 及 IL-13等 Th2 细胞因子过量表达。

1.实验动物
  SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。

2.实验分组
  实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

3.主要试剂
  卵蛋白（OVA）
  明矾

4.实验周期
  6W

5.建模方法
  5.1 明矾致敏佐剂：10%明矾溶液（溶于双蒸水）2ml与500ug/ml OVA（溶于PBS）2ml等量混合后，用NAOH调PH值为6.5，室温孵育60min，750r/min，离心5min，去掉上清液，重溶于2ml PBS。致敏时每只小鼠腹腔注射200ul，其中含2mg明矾和100ug OVA。
  5.2 致敏：小鼠分别于第0、14天时腹腔注射明矾致敏佐剂0.2ml，对照组注射相同剂量的PBS溶液，正常饮食饲养。
  5.3 激发：雾化吸入，第21天时小鼠放入有机玻璃箱，5% OVA雾化吸入。每天30min，共7d，最后一次致敏后24h内检测。以小鼠出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛等阳性反应作为造模成功的标准。对照组采用PBS雾化吸入，其他操作均相同。
  5.4 末次激发24h麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。取左肺组织于4%多聚甲醛溶液中固定用于病理染色；右肺组织液氮冷冻，-80℃保存用于分生标本。

6.模型评估
  6.1 一般观察 哮喘模型组大鼠在激发开始后出现打喷嚏、点头呼吸、呼吸急促、哮鸣音、腹肌收缩、烦躁等典型哮喘发作症状，并且后期观察中发现饮食减少、毛色无光泽、行动迟缓及体重逐渐下降。
  6.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集最后1次激发24 h后(第28天)将各组小鼠颈椎脱臼处死,无菌条件下分离气管,结扎左主支气管后,剪开右主支气管插入气管导管并固定,无菌生理盐水灌洗3次, 1mL/次,收集的BALF于4℃1200 r.min-1离心5 min,弃去上清液, PBS重悬细胞沉淀并涂片,进行细胞分类。
  6.3 肺组织病理学
  取左肺组织用4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋， 4μm切片，HE染色。正常组支气管无明显炎症细胞浸润，结构正常。哮喘组可见弥漫性细小支气管和血管周围炎性细胞浸润，其中嗜酸细胞显著增多。气道上皮有不同程度脱落，支气管豁膜上皮杯状细胞增生，管腔内可见豁液栓及炎性渗出，支气管平滑肌显著增厚，血管周围水肿。
  6.4 细胞因子的检测
  模型组血清中IL-25、IL-4的含量显著高于对照组。采用ELISA试剂盒检测血清中IL-25、IL-4的含量。

 
图1 小鼠哮喘模型雾化激发

图2 正常小鼠。肺支气管、血管及肺泡（↑）(HE染色)

图3 哮喘小鼠。肺泡塌陷，间隔增宽，部分肺泡扩张（↑）(HE染色)

图4 哮喘小鼠。血管壁显著增厚，周围炎性细胞浸润，其中嗜酸细胞显著增多（↑）(HE染色)