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小鼠脑缺血模型

 大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion，M*) 是目前最常用的局灶性脑缺血模型,M* 模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。

1.实验动物
 SPF级BablC小鼠，健康，雄性，体重为25g-30g。

2.实验分组
  实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

3.主要试剂
  2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride（sigma）

4.建模方法
  4.1 3%戊BA比妥钠麻醉小鼠，颈部备皮，消毒，插入肛温探头，保持体温在37±0.5℃。
  4.2 颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。使用7-0丝线在距离颈总动脉分叉2mm处结扎颈外动脉远心端，在颈外动脉穿入另一根7-0丝线，在靠近颈总动脉分叉处打一个活结。
  4.3 使用动脉夹夹闭颈总动脉。在距离颈总动脉分叉处1.5mm处的颈外动脉上剪一个小口，将一根头端处理过的0.18mm直径的尼龙线从小口中插入，进入颈内动脉，并向内插入大脑中动脉，尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约9±1mm。
  4.4 缺血后60min拔掉线栓，用7-0丝线结扎外动脉近心端，用5-0丝线缝合颈部伤口，活力碘消毒伤口，将小鼠放在加热垫上，待清醒后放入恒温抚养箱饲养。
  4.5 术后24h，对小鼠进行神经功能评分，然后麻醉小鼠，取大脑进行TTC染色和病理染色。

5.模型的评价
  5.1 神经功能缺失体征评分 
  参考Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评分，分值越高,说明动物行为障碍越严重。
    0分:无神经损伤症状
    1分:不能完全伸展对侧前爪
    2分:向对侧转圈
    3分:向对侧倾倒
    4分:不能自发行走,意识丧失
  5.2 TTC染色
  麻醉小鼠后，取小鼠脑组织，放入-20℃冰箱冷冻30min。用PBS配置1% TTC（W/V），37℃水浴至TTC溶解，将冻好的脑组织切片，置于10ml TTC溶液中，37℃恒温孵育10min。不时翻动脑片，使组织均匀染色。正常脑组织染色后呈鲜红色，而梗死区呈苍白色。
  5.3 病理学评价
  取脑后用4%多聚甲醛溶液固定，蔗糖溶液脱水后，经OCT包埋做冰冻切片，切片10um，做尼氏染色，可做梗死面积的评价。
  尼氏体（Nissl body）：是胞质内的一种嗜碱性物质，广泛见于各种神经元，但其形状大小和数量则各有差异。在生理情况下,尼氏体大而数量多,反映神经细胞合成蛋白质的功能较强,在神经元受损时,尼氏体的数量可减少甚至消失。

 
图1 TTC染色图（白色表示梗死组织，红色表示正常组织）