实验服务
价格： 10,000元
地 址：重庆
周 期：20天
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服务简介
清洁级SD大鼠，雌性，3-4周，若干，购于第三军医大学动物实验中心
二、主要仪器及试剂
1、主要实验仪器
80/150/200目不锈钢细胞筛 | 上海生工，中国 |
电热压力蒸汽消毒器 | 浙江绍兴医疗器械总厂 |
超净工作台 | 苏州净化设备公司 |
二氧化碳培养箱 | 三洋（Sanyo），日本 |
电热恒温鼓风干燥箱 | 上海跃进医疗器械厂 |
低速台式离心机 | 上海安亭科学仪器厂 |
倒置显微镜 | OLYMPUS，日本 |
照像系统 | OLYMPUS，日本 |
移液器 | Eppendorf，德国 |
细胞计数板 | 上海医用仪器厂 |
细胞培养瓶及细胞培养板 | Costar，美国 |
各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管 | Axygen，美国 |
0.22um纤维素滤膜 | MILLIPORE，美国 |
0.45um混合纤维素滤膜 | MILLIPORE，美国 |
剪刀、镊子 | 中山恒基达医疗器械 |
2、主要试剂
EBM-2Kit培养基 | LONZA ，瑞士 |
胎牛血清 | Gibco，美国 |
PBS | 北京中杉 |
青霉 素-链霉素溶液（100×） | 碧云天，中国 |
EBM-2Kit培养基 |
3、主要试剂配制
（1）EBM-2Kit培养基：按说明书加入生长因子和血清（2%FBS）。
（2）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂用ddH2O定容至1000 mL，调pH7.2，121℃、30min高压灭菌，4℃保存备用。
三、 细胞操作实验方法
（1）取SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。
（3）去除骨骺端，用1mL无菌注射器吸取DMEM溶液冲洗骨髓直至骨髓腔变白，吸入离心管内，1000rpm离心5min，弃上清。用PBS重悬细胞沉淀。
（4）缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。
（5）2000rpm离心20min，离心后溶液分5层，吸取中间骨髓基质细胞层（白膜层），PBS洗3次。
（6）用含生长因子和血清（2%FBS）的EBM-2培养基以106/mL细胞浓度接种于6孔板中，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，48h后取出未贴壁细胞继续培养。
四、无菌操作注意事项
细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。
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