实验服务
价格： 10,000元
地 址：重庆
周 期：20天
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服务简介
一、实验动物
大鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司。
二、主要仪器及试剂
80/150/200目不锈钢细胞筛 | 上海生工，中国 |
电热压力蒸汽消毒器 | 浙江绍兴医疗器械总厂 |
超净工作台 | 苏州净化设备公司 |
二氧化碳培养箱 | 三洋（Sanyo），日本 |
电热恒温鼓风干燥箱 | 上海跃进医疗器械厂 |
低速台式离心机 | 上海安亭科学仪器厂 |
倒置显微镜 | OLYMPUS，日本 |
照像系统 | OLYMPUS，日本 |
移液器 | Eppendorf，德国 |
细胞计数板 | 上海医用仪器厂 |
细胞培养瓶及细胞培养板 | Costar，美国 |
各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管 | Axygen，美国 |
0.22um纤维素滤膜 | MILLIPORE，美国 |
0.45um混合纤维素滤膜 | MILLIPORE，美国 |
剪刀、镊子 | 中山恒基达医疗器械 |
2、主要试剂
DMEM培养基 | Gibco，美国 |
胎牛血清（FBS） | Gibco，美国 |
胰蛋白酶 | 碧云天，中国 |
PBS | 北京中杉 |
青霉素-链霉素溶液（100X） | 碧云天，中国 |
DMSO | Amresco，美国 |
3、主要试剂配制
（1）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min高压灭菌，4℃冰箱保存。
（2）DMEM细胞生长培养液：临用前根据需要按体积比10%加胎牛血清，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，再加入5ng/mL的SCF，置于4℃冰箱保存。
（3）细胞冻存液：生长培养基（含20%胎牛血清）或100%胎牛血清，加入10%的DMSO混合均匀，置于4℃冰箱保存。
三、实验步骤
1. 取大鼠，使用7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，在无菌条件下迅速取出脂肪组织。
2. 用含１％青链双抗的D-Hank’s 液冲洗3次。剥离脂肪组织上的血管。
3. 将脂肪组织剪碎，直到组织变为液体状，加入8-10mL 胰酶，37℃消化90min。
4. 消化完成后，加入等量含血清DMEM 培养基终止消化，过200目筛网去除大块组织
5. 以1500r/min 离心5min，去上清液，加入含血清DMEM 培养基重悬细胞。
6. 接种至６ 孔板，放入细胞培养箱（37℃，CO2 浓度5％）。细胞稳定培养24h后换液，冲去未贴壁的细胞，更换DMEM培养基（成分同上）继续培养。以后每2天换液１ 次，注意观察培养基有无浑浊、颜色变淡、漂浮物和絮状物等
四、细胞形态
大鼠脂肪间充质干细胞培养过程中，约24h即可贴壁生长，细胞呈长梭形生长速度较慢。换液后细胞增殖明显，出现以长梭形为主的形态，5- 7d 70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈长梭形。
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