服务简介

一、实验动物

 清洁级SD大鼠乳鼠，若干，购于第三军医大学动物实验中心

二、主要仪器及试剂

1、主要实验仪器

2、主要试剂

         DMEM-F12培养基        （Gibco，美国）

胰蛋白酶          （Beyotime，美国）

PBS                 （ 中山，北京）

胎牛血清             （Gibco，美国）

青霉素               （华北制药厂，中国）

链霉素              （华北制药厂，中国）

3、主要试剂配制

(1)PBS：用购自中山公司的PBS粉剂，每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，高压灭菌消毒。

(2) 0.25%胰蛋白酶消化液：使用时浓度为0.25%，含0.02%EDTA，制备时即取250mg胰酶和20mgEDTA溶于100mLPBS溶液，并在无菌操作台上用0.22um一次性过滤器过滤，50ml分装，4℃保存。

(3) DMEM-F12细胞生长培养液：临用前根据需要加10%胎牛血清，1%的ITS，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL，置于4℃冰箱保存。

(4)抗生素：青霉素(80万U)和链霉素(100万U)在无菌操作台内以高压灭菌过的双蒸水溶解(分别加入4ml灭菌水/青霉素，5ml灭菌水/链霉素)，配制成20万u/ml分装，置于-20℃冰箱保存，临用时4℃解冻，注意尽量避免反复冻融，并使培养基最终浓度为100 u/ml。

(5)细胞冻存液：生长培养基（含20%胎牛血清）或100%胎牛血清，加入10%的DMSO混合均匀，置于4℃冰箱保存。

三、细胞操作实验方法

1、细胞生长培养基的制备

培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和双抗，一般为10%~20%血清。培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 按细胞生长需求，制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清+1%ITS，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL。

2、大鼠心肌成纤维细胞原代分离培养

（1）将SD乳鼠在75%酒精中浸泡1-5min，然后固定在泡沫板上，先用碘酒消毒胸腹部，再用酒精消毒。取出无菌剪刀和镊子，先用酒精棉球再次消毒，剪开胸，取心尖部位，快速置于含双抗的预冷的PBS溶液润洗3遍。

（2）剔除周围结缔组织，将心脏置于无菌平皿中，将心脏尽量剪碎，平皿内加入适量0.125%的胰酶，在37度培养箱中，采用分次消化，每次消化5分钟，一共消化8~10次。

（3）每次消化后取上清液，并加入等量的含10%的DMEM/F12培养基，轻轻混匀，中和胰酶的消化，防止消化多度。用100目细胞过滤筛子过滤含细胞的混合液，最后将过滤后的细胞悬液1000R/MIN离心5分钟。离心后收集沉淀，用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬。于细胞培养瓶中培养。

（4）在培养90分钟左右，将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞，加入DMEM/F12培养基，放入培养瓶继续培养。

（5）24h换液，并每日观察心肌成纤维细胞的生长。

四、无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

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