服务简介

一、实验动物

SD大鼠，2周龄，若干，购于第三军医大学实验动物中心。

二、主要仪器及试剂

1、主要仪器设备

电热压力蒸汽消毒灭菌锅(XDD)           （浙江绍兴医疗器械总厂）

超净工作台                   （苏州净化设备公司）

生物安全柜                   （上海博讯实业有限公司） 

TC2323型CO2恒温细胞孵箱               （美国SHEL LAB 公司）

电热恒温鼓风干燥箱               （上海跃进医疗器械厂）

高速台式离心机(BACKMAN CS-15R)            （美国Beckman公司）

0.22um除菌滤器                     （德国BM公司）

恒温循环水浴锅                  （Pharmacia公司生产）

迷你型超速离心机                 （德国Eppendorf公司生产）

微型高速冷冻离心机               （德国Eppendorf公司生产）

1/10000电子天枰(Sartorius AC-211)     （德国）

细胞培养瓶及细胞培养板(Costar)        （美国）

各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管      （美国Axygen公司）

细胞计数板                         （上海医用仪器厂）

微量移液器                 （德国Eppendorf公司）

光学显微镜(OLYMPUS)                （日本）

倒置显微镜（OLYMPUS)            （日本）

照像系统(OLYMPUS)                 （日本）

2、 主要试剂   

   DMEM-F12培养基     （GIBCO，美国）

台盼蓝粉末                      （Sigma，美国）

淋巴细胞分离液                    （TBD）

3、 主要试剂配制

    (1)PBS：用购自中山公司的PBS粉剂，每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，高压灭菌消毒。

三、 实验步骤

 1、细胞生长培养基的制备

培养基在使用前需加入10%的胎牛血清和双抗，一般为血清。培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 按细胞生长需求，制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL。

 2、大鼠骨髓间充质干细胞的分离

（1）取SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。

（3）从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞。

（4）缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。

（5）2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨髓基质细胞层（白色浑浊状），PBS洗三次。

（6）用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以10⁶/mL的细胞浓度接种于625px²培养瓶中，置37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养。

（7）24小时后弃去培养液（看细胞贴壁情况），PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合。

（8）经0.25%胰酶消化，1：2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

四、细胞形态观察

骨髓间充质细胞原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。

五、无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

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