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实验原理：对多肽蛋白样品先进行酸水解处理，得到游离氨基酸溶液，然后用合适的衍生剂进行柱前衍生，赋予氨基酸以疏水结构和吸收基团，然后使用反相液相色谱-紫外检测器分离并检测。异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法：PITC 与氨基酸在弱碱性条件(pH≈9.0)下反应生成噻唑啉酮苯胺衍生物，衍生物在反相柱上具有较强保留并在254 nm 下具有明显吸收。

实验方法：

1）样品处理：

多肽蛋白样品酸水解：取一定量的多肽蛋白样品，转移至水解管中，加入1ml 6M

的盐酸，充入N2约10min，之后密封后放置于Block Heater 干式加热器模块中，110℃ 水解反应24h。反应完毕后，将游离氨基酸溶液转移至1.5ml EP 管中，抽真空浓缩至干。

2)异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法：

混合氨基酸标准品衍生化处理：取25μl 混合氨基酸标准品溶液，加入12.5μl1mol/L 三乙胺涡旋混合震荡，之后加入12.5μl 0.1mol/L PITC 涡旋混合震荡室温静置1h，加入100μl 正己烷剧烈混合震荡后静置10min，取下层溶液20μl，加入180μl 流动相A 溶液，混合后0.22μm过滤处理待测试。样品溶液衍生化处理：取适量流动相A 液复溶已冻干样品游离氨基酸，取25μl 样品氨基酸溶液，加入12.5μl 1moL/L 三乙胺涡旋混合震荡，之后加入12.5μl 0.1mol/L PITC涡旋混合震荡室温静置1h，加入100μl 正己烷剧烈混合震荡后静置10min，取下层溶液20μl，加入180μl 流动相A 溶液，混合后0.22μm 过滤处理待测试。

3) 高效液相色谱测试：

衍生化好的氨基酸衍生物通过岛津高效液相色谱仪LC-20AT 分离检测，相关参数如下：A 液为0.05mol/L 乙酸钠水溶液，B 液为甲醇乙腈水溶液(甲醇：乙腈：水=20：60：20(V：V：V))。流速为：1.0mL/min；柱温：35℃；色谱柱以95%的A 液平衡后，样品由自动进样器上样到氨基酸分析柱。分离梯度为： 0 分钟--- 39 分钟，B液线性梯度从 5 % 到 48 % ； 39 分钟--- 40 分钟，B 液线性梯度从 48 %到 100% ； 40分钟---- 45 分钟，B 液维持在100%，45 分钟---46 分钟，B 液线性梯度从100 %到 5 %，46 分钟---- 60 分钟，B 液维持在5%。

4)高效液相色谱数据处理：

高效液相色谱LC-20AT 产生的原始数据由仪器自带软件Labsolution 进行手动积分标峰处理，首先对氨基酸混合标准品进行积分标峰并建立外标法对应方法，之后调用建立方法对样品色谱图进行自动积分标峰处理，并得到样品的氨基酸组成摩尔百分比。