服务简介

                                                 重组蛋白原核表达服务

重组蛋白表达服务 — 原核表达
大肠杆菌（E.coli）重组蛋白表达技术经过多年的发展，已经变得非常成熟。但要在大肠杆菌表达体系获得不错的可溶以及高产量的蛋白表达，一个优秀的表达策略必不可少。卡梅德生物科技的专家在蛋白表达和抗体制备方面具有独到的经验和丰富的知识储备，对每一个客户提出的特殊要求，我们尽可能提出完美的解决方案。为了表达重组蛋白的高效表达以及有活性蛋白的表达，通常以下几个方面会涉及：

问题1：宿主体系选择
首先要强调的是客户要求不同，我们选择的表达宿主体系也不尽相同：细菌、酵母、丝状真菌和单细胞藻类。每一种表达宿主都有各自的优缺点。例如，如果需要表达的蛋白具有真核的翻译后修饰（糖基化修饰），那么大肠杆菌等原核表达体系并不适用。大肠杆菌表达体系的优点是：
（1）菌体繁殖速度快：20分钟倍增一次，这意味着按照1/100的比例接种（MOI），只需要几个小时培养基细菌即可到达稳定期；
（2）容易实现高密度培养：理论培养密度是1 × 1013 cells/ml，实际培养过程中使用LB培养基在37℃培养大肠杆菌，<1 × 1010 cells/ml。在低温（11℃）诱导蛋白表达时，细菌个数几乎不增长。
（3）转染外源DNA容易，质粒转染效率高。

问题2：表达质粒体系选择
目前最为常用的重组蛋白表达质粒载体融合了复制子(Replicon)、启动子(promoter)、筛选标签(selection marker)、多克隆位点（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy)

复制子：包含复制起始点及相关顺式作用控制元件（cis-acting control elements）。在选择合适的质粒载体时，质粒拷贝数应当是需要我们考虑的一个重要参数。卡梅德生物拥有几个常用的载体系列，如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101。pET系列载体含有pMB1起始子，在单个菌体中通常含有15-60 copies；pUC系列含有一个突变版本的pMB1起始子，在该系列的载体在单个细菌通常有500–700 copies；pACYC和pBAD系列常被用于双表达体系，如FRET系统，该系列含有p15A起始子，单个细胞含有10-12个copies；pSC101系列载体单个细胞中的拷贝数通常<5个，常被用于三种蛋白的共表达。结合这些质粒的特点，我们的科学家通过改造pET载体，获得双表达质粒（BiPlasmid vector），该质粒含有双MCS位点，双T7启动子，双lac操纵子和双核糖体结合位点，利用该质粒我们可以为客户进行一次转染操作，而获得两种蛋白的独立表达。

启动子：重组蛋白大肠杆菌表达体系中，lac启动子是最为常用的启动子之一。当培养基中只存在乳糖（lactose）作为唯一碳源时，lac启动子被激活，开始重组蛋白表达。我们常用带T7启动系统的pET系列载体为客户表达目的蛋白，当含有T7启动系统的质粒转染进入细菌后，挑取单克隆，培养并加入IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一种非水解性的乳糖类似物）诱导细菌表达重组蛋白。为了消除重组蛋白本底表达，我们在原先的pET系列质粒载体基础上加入了T7溶酶体与T7 RNAP（RNA polymerase）共表达，T7溶酶体能够结合T7 RNA聚合酶并限制T7启动子介导的起始转录。

抗性筛选标签：质粒载体通常采用的抗性基因包括氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素，庆大霉素和四环素等抗性基因，在重组蛋白表达与纯化过程中，大部分加入的外源抗生素自然降解(如氨苄青霉素37℃条件下半衰期为16小时)或被去除掉，只剩下微量残留（一般<1pg/ml纯化蛋白），我们开发了相应的ELISA试剂盒能够快速检测抗生素残留量（检测灵敏度0.1pg/ml）。

亲和标签：重组蛋白表达过程中采用亲和标签一方面是为了使蛋白纯化过程更加容易；另一方面是为了促进某些不溶性蛋白可溶。蛋白标签可分两类：一类是短肽类标签；一类是长肽以融合蛋白（fused partner）形式共表达。长肽类标签更多的作用是促进蛋白可溶性，往往需要同时加入短肽标签以帮助蛋白纯化；短肽类标签一般只含几个氨基酸，分子量均<2 kDa，对重组蛋白的性质影响较小。亲和标签可以放置在蛋白的C-端和N-端，如需要表达分泌性蛋白，则放置于C-端，信号肽放置于N-端。

标签移除：一般性的生物学研究过程中，蛋白标签可以不用移除，如GST pull down实验和CO-IP实验则需要保留GST和His标签以便将目的蛋白从混合物中直接分离出来。当涉及到蛋白结构研究时，则蛋白标签或融合伴侣需要被移除掉。去除蛋白标签的方法分为两类，一类是酶消化法；一类是化学裂解法。化学裂解法通产被用于融合伴侣蛋白的移除，如CNBr用于裂解与Met氨基酸C-端连接的多肽，该方法优点是价格便宜，缺点是蛋白序列中不能存在Met氨基酸残基。酶消化法是目前最为常用的蛋白标签去除方法，如腸激脢（Enterokinase），凝血酶（thrombin），factor Xa和烟草蚀刻病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白标签，只残留少数几个氨基酸残基。带有His标签的TEV蛋白酶逐渐被广泛接受用于蛋白标签移除实验，该蛋白酶具有一个非常优秀的特点:切除标签后，只残留一个Ser或Gly残基或完全不残留氨基酸残基。这也是目前卡梅德生物科技常用的一种蛋白标签去除方法。

问题三：选择合适的蛋白表达宿主

重组蛋白原核表达常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作为表达宿主。Studier 于1986年提出BL21菌株，随后不同基因工程修饰菌株随之诞生。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT，Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基质蛋白。同时BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突变，菌株失去甲基化和降解外源转染质粒的能力，使得质粒能够传代保留至子代细菌中（hsdSB突变基因来源于父辈B834菌株）。

K-12系列菌株具有两大优点：一个是能够促进胞质中蛋白二硫键的形成，主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因发生突变；另外一个是recA基因突变，改基因突变后外源质粒在宿主菌种中得以稳定存在。

问题四：成功表达一个重组蛋白，需要的策略组合

重组蛋白的表达往往不像理论那样一帆风顺，在实际的表达过程中有可能产生各种各样的问题。

在选择一个最优的蛋白表达策略非常困难的情况下，那么采用看似笨拙的方法，有可能会成为一种意想不到的“成功捷径”，比如项目要求构建表达两种重组蛋白时，构建6种不同的表达质粒，意味着有36种不同的表达条件组合，通过高通量微量蛋白表达实验一次性就可获得最佳蛋白表达条件组合，后续中式飞行试验和成本控制会变得相对容易。

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