iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术是生物学领域应用广泛的两种蛋白质标记定量技术。该技术分别通过与多肽氨基末端以及赖氨酸残基伯氨基结合,实现对多肽的标记。在质谱分析时,不同样本的同一肽段标记后表现为相同的质荷比,被同时选择进行二级碎裂,产生质量不同的报告离子,通过报告离子的丰度实现不同样品间蛋白质的定量。 应用领域:适用于不同样本的蛋白质组定量研究。 技术优点:1.适用于各种动植物组织/细胞、微生物、体液样品分析2.一次实验同时对多达2-10个样本进行定量分析3.一次实验可获得高通量的定量数据采用仪器:iTRAQ/TMT技术流程:样本经过不同处理后提取蛋白质,蛋白质经过还原,封闭后蛋白酶酶切(通常为trypsin),肽段混合物分别用不同的iTRAQ/TMT试剂标记,等量混合各种iTRAQ/TMT试剂标记的肽段, MS/MS质谱检测及分析。 数据分析内容:1.数据库鉴定数据统计2.蛋白质/肽段鉴定及定量结果3.差异蛋白质统计分析4.蛋白质Pathway代谢通路分析 及差异蛋白的Pathway富集分析5.多样品间分类统计、功能富集、 聚类分析(适用于样本数≥3的项目) 样品要求:蛋白提取物:≥100ug细胞:≥107组织:动物组织≥100mg,植物组织≥10mg体液:血清/血浆≥500μL,尿液≥25mL,唾液、脑脊液等体液≥5ml其他样本如有疑问请联系我们 参考文献:1 Richard, D. U.et.al. Simultaneous analysis of relative protein expression levels across multiple samples using iTRAQ isobaric tags with 2D nano LC–MS/MS.Nature Protocols 5,1574-1582(2010).2 Josselin Noirel1. Methods in Quantitative Proteomics: Setting iTRAQ on the Right Track. Current Proteomics 2011, 8, 17-30.3 Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat Methods 2007, 4(3):207–214.4 Altelaar A.F., et al. Benchmarking stable isotope labeling based quantitative proteomics. J Proteomics Oct 22. pii: S1874-3919(12)00704-X. doi: 10.1016/j.jprot.2012.10.009.5 Zhang, T., et al. (2010). Improving quantitation of TMT-labeled peptides using stepped higher-energy collisional dissociation. Application note # 483www.thermoscientific.com6 顾培明,李静. 应用Orbitrap Fusion对TMT标记样本进行MS2定量方法及SPS MS3定量方法的比较.塞默飞世尔(中国)有限公司.Application Notes CM0098.
一、二硫键简介 二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰,对稳定蛋白质的空间结构,保持及调节其生物活性有着非常重要的作用。 因此,确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白化学结构的重要方面。在众多实验方法中,现代质谱技术因其操作简单、快速、灵敏等优点而成为分析二硫键的重要手段。目前主流的高分辨率质谱仪,具有分辨率更高,质量稳定性更好,复杂基质中分析的灵敏度更高等优势。 二、技术优点1、串联质谱的谱图可以给出更多二硫键的定位信息。2、质谱方法方便、快捷、灵敏度高。 三、技术流程1、对已知蛋白序列进行分析,根据理论酶切肽段信息选择合适的蛋白酶。2、蛋白浓缩及浓度测定,在非还原条件下进行酶切,将蛋白酶解为肽段。3、酶切后肽段通过液相质谱联用系统进行检测。4、计算二硫键存在的条件下肽段的M/Z,在质谱数据中检索目标肽段的质谱峰,确定二硫键连接方式。5、总结结果并撰写检测报告。 四、样品要求蛋白纯度>95%,蛋白量>50ug,不能接触DTT等还原试剂,不能高温,使二硫键保持完整,避免二硫键断裂及重排的现象发生。
一、双向电泳简介第一向等点聚焦,蛋白质是两性分子,在不同的pH环境中有不同的带电荷状态。每个蛋白质都有一个特定的pH,此时蛋白质的静电荷为零,此pH值即为该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时,蛋白质因带电荷而在胶条中移动,当蛋白分子可能获得或失去质子,并且随着移动的进行,该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时,其净电荷数为零,那么在电场中则不再移动。第二向是聚丙烯酰胺凝胶电泳,将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS-PAGE凝胶上,根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一向进行垂直的分离。如与质谱鉴结合,还可实现蛋白质的定性分析,是蛋白质组学研究的经典方法。双向电泳在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都有广泛应用。二、技术优点1、应用范围广、适用于多种样本的蛋白组分析;2、能够对复杂蛋白进行分离,经济实惠,可大规模多个样本筛选和进行差异分析。三、技术流程 四、技术服务内容1、蛋白质提取及定量;2、双向凝胶电泳胶制备与图片分析;3、蛋白质差异点分析及质谱鉴定;4、双向电泳实验检测报告整理。五、样品要求蛋白提取物:≥1mg,蛋白浓度大于5mg/mL,样品中无盐成分;组织样本每份约250-500mg;细胞样品每份106—107细胞数(一块胶);血液、血清等样品大于5mL,且不能溶血;植物或真菌样品量湿重不少于2g。