16S rDNA分子生态测序服务概述微生物分子生态学研究(Microbial Phylogeny Study)研究利器随着生物技术的飞速发展,传统的微生物鉴定方法常常难以鉴定众多的生长习性复杂的微生物,因而基于基因组序列的分子鉴定受到广泛关注。在细菌基因组中,编码 16S rRNA 的 rDNA 基因具有良好的进化保守性,适宜分析的长度(约为1540bp),以及与进化距离相匹配的良好变异性,所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。16S rDNA的序列包含9或10个可变区(variable region)和11个恒定区(constant region)。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系,而高变序列区域则能体现物种间的差异。16S rDNA分子的序列特征为不同分类级别的近缘种系统分类奠定了分子生物学基础。目前16SrDNA的序列信息已经广泛应用于菌种鉴定和系统发生学研究。我们利用Ion Torrent平台为您提供Ion Torrent 16s rDNA分子生态测序,帮助您更高效、快速地进行微生物分子生态研究。图为 16s rDNA 序列碱基变异情况研究内容:16s rDNA的不同可变区测序 各种环境的菌群结构分析技术路线:数据分析流程:数据结果:数据质量评估报告; 提取有效序列及统计; 生成OTU,及OTU分布统计; 丰富度稀疏曲线、香农指数曲线及Rank-abundance曲线; OTU物种鉴定及群落组成分析; 样品相似性分析; 样品间OTU分布比较(韦恩图、聚类图); 主成分分析(PCA)(样品数 ≥ 3)。南方基因 Ion Torrent 服务介绍:Ion Torrent平台采用了半导体技术和简单的化学试剂进行DNA测序,而不是使用光作为媒介。在半导体芯片的微孔中固定DNA链,随后依次掺入ATCG。随着每个碱基的掺入,释放出氢离子,在它们穿过每个孔底部时能被检测到,通过对H+的检测,实时判读碱基。Ion Torrent技术优势:更准确:系统无激光光源,无化学系统,无照相系统;使用无标记的核苷酸及酶进行测序,本底干扰低。通过对H+的检测,明显改善碱基判读准确性。更快速:最短测序时间仅为2-3小时,24小时之内可完成6-8轮实验;达Sanger测序方法每天测序通量的数千倍以上;弥补了已有高通量测序方法“无快速测序模式”的缺陷。更灵活:可满足不同通量的测序需求。技术原理:1、脱氧核苷酸分子流过芯片微孔; 2、如果脱氧核苷酸与微孔中的DNA分子互补,则该核苷酸被合成到DNA分子中,并且释放氢离子,该孔溶液的PH发生变化; 3、感应层检测到PH变化; 4、感应层将PH变化的化学信息转变为电压变化信息; 5、电压变化信息转变为数字电子信息。如果DNA链含有两个相同的碱基,则记录电压信号是双倍的。如果碱基不匹配,则无氢离子释放,也就没有电压信号的变化。
Affymetrix SNP芯片服务人类基因组由30亿个核苷酸组成,它们携带着人类的遗传信息并决定人体的生理特征。人类基因组序列的0.1%—0.2%在人种、人群和个体之间存在DNA序列差异,即单核苷酸多态性(SNP,single nucleotide polymorphism)。许多的这些单核苷酸多态性可引起不同的遗传性状,即遗传的多态性(polymorphism),如ABO血型位点标记,白细胞HLA位点标记和个体药物代谢差异等。了解这些DNA序列的差异和单核苷酸多态性以及这些差异所表现的意义将给疾病的预测、诊断、预后和预防带来革命性的变化Affymetrix SNP芯片服务芯片推荐:1、Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片介绍:Affymetrix Genome-Wide Human SNP 6.0芯片产品的涵盖超过1,800,000个遗传变异标志物:包括超过906,600个SNP和超过946,000个用于检测拷贝数变化(CNV,Copy Number Variation)的探针:1)482,000个SNPs来自于前代产品500K和SNP5.0芯片; 2)424,000个SNP包括了源来于国际HapMap计划中的标签SNPs,X,Y染色体和线粒体上更具代表性的SNPs,以及来自于重组热点区域和500K芯片设计完成后新加入dbSNP数据库的SNP; 3)202,000个用于检测5,677个已知拷贝数变异区域的探针,这些区域来源于多伦多基因组变异体数据库。该数据库中的每个3,182个非重叠片断区域分别平均用61个探针来检测; 4)744,000个探针平均分配到整个基因组上,用来发现未知的拷贝数变异区域。具体应用:除了SNP基因分型之外,还能进行CNV研究。从而能够进行Copy-neutral LOH/UPD检测,亲子鉴定,纯合性分析、血缘关系鉴定。芯片推荐:2、Affymetrix Mouse Diversity Genotyping Array芯片介绍:这款芯片与Human SNP 6.0 芯片类似,既包含SNP探针,也包含CNV探针。一共涵盖623,124个SNP位点和916,269个CNV探针。芯片推荐:3、Affymetrix GeneChip Rice 44K SNP Genotyping Array芯片介绍:芯片覆盖indica, aus, tropical japonica, temperate japonica, and group V (“aromatic”)多个水稻亚种的44,1000个SNP。 芯片特点:1.全基因组覆盖:每10kb至少包括1个SNP,每个SNP设计12个探针技术重复相关系数R2 > 99%。2.简便的样本:叶组织或抽提的DNA便可快速灵活的对遗传种质进行鉴定和分类。3.从实验样本DNA到数据快速转换。其它物种商品化SNP芯片包括:牛(bovine和buffalo),鸡,水稻,生菜,胡椒,拟南芥,狗和小鼠。如有其它物种定制需求,可电话咨询。服务相关(以Affymetrix SNP6.0芯片为例)样品要求1. 样品纯度:OD 260/280值应在1.7~2.0 之间;RNA 应该去除干净;不得有其它个体或其它物种的DNA污染。2. 样品浓度:浓度不低于55ng/µl。 3. 样品总量:每个样品总量不少于1µg。 4.样品溶剂:溶解在Reduced TE (10mM Tris, pH 8,0,0.1mM EDTA)中。 5. 样品运输: DNA低温运输(-20℃);在运输过程中请用parafilm将管口密封好,以防出现污染。服务内容1. DNA抽提; 2. 样品质检:用琼脂糖凝胶电泳或LAB-ON-CHIP系统对样品DNA进行质量检测和定量; 3. 实验过程: a、扩增,标记; b、杂交、洗脱(具体见左图); 4. 图像扫描:用Affymetrix Scanner3000 7G激光共聚焦扫描仪对杂交结束后的芯片进行扫描; 5. 数据处理:确定检出的SNP位点相应的核苷酸。数据分析流程1. SNP位点过滤:1)Nocall rate>=10% 2)最小等位基因频率,Minor allele frequency
Omni芯片家族自2009年上市以来,已经提供了一系列灵活的芯片,它们带来了精选自国际HapMap计划和千人基因组计划的常见和稀有变异。有了Omni芯片家族,研究人员能够立即开始新一代GWAS。一、Omni家族芯片产品信息注:自定义位点是在芯片SNP位点基础上,可自定义添加最大位点数,N/A表示不能添加。二、芯片特点1. Human Omni ZhongHua-8 BeadChip芯片服务 (推荐)___特别覆盖中国特有的常见和稀有变异1)第一款人类种群特异的全基因组芯片,经过优化的标签SNP内容来自HapMap所有三个阶段以及千人基因组计划(1kGP),可用于在中国人种群中探索全新的疾病和性状关联。 2)特别覆盖中国人81%的常见变异(MAF> 5%)和60%的稀有变异(MAF > 2.5%),适合全基因组关联研究(GWAS)。 3)采用Illumina专利的BeadArrayTM技术,可提供非常高的数据质量,平均检 出率> 99%,重复率> 99.9%。2. HumanOmni5-Quad芯片服务1)4个样品的Omni5芯片特有超过430万个标记物/样品。 2)特有来自千人基因组计划的新颖、常见和稀有变异。除了提供人类变异(MAF低至1%)的密集覆盖,覆盖了基因组中与疾病关联的高价值区域,包括基因区域、MHC区域和非同义SNP。 3)特有来自千人基因组计划的近5000个插入缺失和多碱基替换标记物,能帮助研究人员阐明结构变异如何影响性状和疾病。 4)可自定义的 500K位点让研究变得更具灵活性,可以方便更高密度靶定基因组的特定区域。三、实验原理与流程四、服务内容及应用1. 基本流程2. 服务内容1. DNA抽提;2. 样品质检:用琼脂糖凝胶电泳Thermo NanoDrop2000分光光度计对样品DNA进行质量检测和定量;3. 实验过程: a)扩增、片段化、杂交; b)洗脱、标记、染色;4. 图像扫描:用Illumina iScan激光共聚焦扫描仪对杂交反应后的芯片进行扫描;5. 数据处理:确定检出的SNP位点相应的核苷酸。3. 发现CNV五、数据分析1. SNP位点过滤:1) No call rate>=10% 2)最小等位基因频率,Minor allele frequency>0.01 or 0.05 3)不符合哈维平衡的位点,HWE P value
MeDIP-Seq(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing )采用甲基化DNA免疫共沉淀技术,通过5'-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段并进行高通量测序。研究者通过MeDIP Sequencing可以快速有效地寻找基因组上的甲基化区域,从而比较不同样本间DNA甲基化修饰模式的差异。此方法可以覆盖整个基因组范围的甲基化区域并且成本较低,特别适用于多样品的全基因组DNA表观遗传研究。
1.实验部分: 通过杂交富集外显子区域序列,建库,测序。2.序列QC: 去除低质量reads,和连续的低质量片段,去掉接头序列。QC统计reads数量及测序质量。 3.Mapping:由于bwa能准确,快速的将短序列比对到基因组上,而且软件持续更新和说明文档完备,是外显子捕获测序的首选。 4.Sam到bam转换: Samtools的多种工具可以将sam文件转换为bam文件,rmdup工具能去除PCR扩增产生的冗余reads,消除由于文库扩增而导入的突变,降低假阳性。Flagstat统计reads的mapping情况以及比较去除duplicate前后reads数目的反映样品建库的冗余情况。 Picard提供的多个工具,修改bam文件,是之适合于后续的GATK软件包中的工具的处理。 5.Indel区域的reads重新做局部多序列比对: 在indel的边缘,一些错配看起来很像是SNP,通过对dbSNP库及bam文件检测到的indel附近的reads进行局部的重新比对,可以消除indel周边的假阳性SNP。 6.碱基质量重新打分: 测序仪给reads中的碱基的qual值存在一定的偏差,通过经验的错误模型来重新计算的碱基的qual值,重新给reads的各个碱基的qual打分。 7.Call snv和indel: 对处理好的多样品bam文件同时运行UnifiedGenotyper,大大提高call SNP的灵敏度和准确性,多样品同时比较的结果,方便了后续的样品间差异的筛选。 8.突变位点的重新打分: 通过hapmap,omni,dbsnp数据库中已知的突变位点建模优化,对各个突变位点重新打分,筛选。大大降低了假阳性率。 9.注释: 通过ANNOVAR软件对vcf结果注释,关联到多个数据库。