关键词:腺相关病毒,AAV,基因导入,病毒载体 腺相关病毒AAV简介腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒,目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分,然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV,(2)rAAV的低产出,(3)生成有复制能力的AAV。在此我们描述了新的辅助质粒(pH3和pH5),排除了Ad共转染的需求。辅助质粒表达AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。当辅助质粒在没有Ad感染的情况下共转染到人293细胞中,rAAV载体产量超过了pAAV/Ad包装质粒的80倍。另外,有复制能力的AAV在rAAV制备过程中少于0.00125%。此系统的主要优点是(1)无需感染性的腺病毒(2)只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。我们相信该双质粒转染系统因其简便性和高产出而使AAV载体系统能被更广泛地使用。该系统尤其将对多rAAV载体的临床前分析有用。 一、腺相关病毒(AAV)载体广泛用于体内实验研究(定点注射与整体注射)表达稳定高效;非整合,转基因安全性高CMV, EF1a, CAG,GBG, Syn 等启动子可选EGFP、mCherry等荧光蛋白可选二、腺相关病毒(AAV)干扰载体广泛用于体内实验研究(定点注射与整体注射)表达稳定高效;非整合,转基因安全性高构建快捷,序列保证准确标记基因可采用EF1a或GBG启动子表达,稳定高效三、腺相关病毒包装与纯化 腺相关病毒包装采用三质粒系统进行包装,共转染后通过对细胞裂解物进行密度梯度离心纯化和收集病毒。四、腺相关病毒滴度检测检测方法:定量PCR检测病毒基因组中的外源DNA拷贝数实验原理:腺相关病毒的基因组为单链DNA五、腺相关病毒感染细胞对于特定细胞有较高的感染率,如心肌和血管内皮细胞感染温和,表达稳定长效rAAV定位注射脑皮层区域进行基因沉默 Nature medicine, 2013, 19(6): 773-777.六、腺相关病毒定位注射感染范围广,可以用于神经系统、眼睛、心肌、肝脏、肌肉和肺部定位注射或定向给药滴度高,颗粒小,扩散能力强表达稳定,可持续半年以上外源基因定向重组,免疫原性低,极少发生非特异反应和免疫抑制,适合于进行基因治疗研究
实验原理稳转细胞株是指经合适的药物浓度进行药物筛选后,得到外源DNA稳定整合到宿主染色体,并可以长时间表达外源目的基因的细胞。稳定表达细胞株弥补了瞬时感染(或转染)实验中外源基因表达时间短的缺陷,便于长期观察。稳转细胞的筛选需根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,常用的抗性筛选有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)、灭稻瘟素(Blasticidin)等。若实验需求构建稳转细胞株,我们建议通过慢病毒感染细胞进行药物筛选的方法,此方法较质粒转染可以更加有效的将外源基因整合入基因组,且整合位点处于转录相对活跃的区域,从而获得更加高效表达外源基因的稳转株细胞。实验流程实验结果展示
慢病毒包装实验原理慢病毒属于逆转录病毒科,名称源自该种病毒长达数年的潜伏期,其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。HIV-1直径约120nm,含两条正链RNA,可有效的进入细胞核中,对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。对以HIV-1为基础进行的慢病毒载体的改造,主要是去除致病基因减少辅助质粒与载体质粒的同源性,最终体现在滴度、生物安全性和外源基因表达效率上的提高,见结构示意图。慢病毒包装系统特点:可通过顺式作用元件将携带的基因运送到细胞核,将要表达的基因序列整合到细胞基因组中,后续可以通过筛选稳转株获得持续稳定的高表达细胞株系,是转基因研究基因功能研究的常用手段。实验流程慢病毒包装服务客户提供病毒规格客户提供病毒规格提供量赠送阴性对照实验周期过表达慢病毒过表达基因NCBI登陆号及含该基因的质粒载体、测序报告低滴度10^5-10^6 TU/ml10 ml2 ml2周高滴度10^7-10^8 TU/ml1 ml0.2 ml3周干扰慢病毒待干扰基因的NCBI登陆号及靶点序列信息低滴度10^5-10^6 TU/ml10 ml2 ml2周高滴度1-3*10^8TU/ml1ml0.2 ml3周本公司慢病毒包装服务实验结果展示
腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒,可迅速感染分裂和非分裂期细胞,与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞,在细胞核孔附近聚集,并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。通过对野生腺病毒进行改造,保留包装信号序列,去除病毒蛋白的编码序列,不仅增加外源基因的装载容量,而且降低细胞毒性和机体免疫反应,从而获得安全性更高的基因导入系统。而且腺病毒包装过程相对简单可控。腺病毒包装系统的特点:不整合到宿主细胞基因组,无插入致突变性;可进行有效扩增,获得高滴度高纯度的腺病毒。腺病毒种类客户提供病毒规格提供量赠送阴性对照周期低滴度10^8-10^9 IU/ml10 ml2 ml5周过表达腺病毒 基因NCBI登陆号及含该基因的质粒载体、测序报告高滴度10^10 IU/ml1 ml0.2 ml6周高滴度10^11-10^12 IU/ml1 ml0.2ml7周高纯滴度10^11-10^12 IU/ml(动物体内)1 ml0.2ml7周干扰腺病毒 待干扰基因的NCBI登陆号及靶点序列信息 低滴度10^8-10^9 IU/ml10 ml2ml5周高滴度10^10IU/ml1 ml0.2ml6周高滴度10^11-10^12 IU/ml1 ml0.2ml6周高纯滴度10^11-10^12 IU/ml (动物体内)1 ml0.2ml6周我们的腺病毒包装实验结果高效快速,获得的腺病毒滴度高转染效率高