实验原理:对多肽蛋白样品先进行酸水解处理,得到游离氨基酸溶液,然后用合适的衍生剂进行柱前衍生,赋予氨基酸以疏水结构和吸收基团,然后使用反相液相色谱-紫外检测器分离并检测。异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法:PITC 与氨基酸在弱碱性条件(pH≈9.0)下反应生成噻唑啉酮苯胺衍生物,衍生物在反相柱上具有较强保留并在254 nm 下具有明显吸收。实验方法:1)样品处理:多肽蛋白样品酸水解:取一定量的多肽蛋白样品,转移至水解管中,加入1ml 6M 的盐酸,充入N2约10min,之后密封后放置于Block Heater 干式加热器模块中,110℃ 水解反应24h。反应完毕后,将游离氨基酸溶液转移至1.5ml EP 管中,抽真空浓缩至干。2)异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法:混合氨基酸标准品衍生化处理:取25μl 混合氨基酸标准品溶液,加入12.5μl1mol/L 三乙胺涡旋混合震荡,之后加入12.5μl 0.1mol/L PITC 涡旋混合震荡室温静置1h,加入100μl 正己烷剧烈混合震荡后静置10min,取下层溶液20μl,加入180μl 流动相A 溶液,混合后0.22μm过滤处理待测试。样品溶液衍生化处理:取适量流动相A 液复溶已冻干样品游离氨基酸,取25μl 样品氨基酸溶液,加入12.5μl 1moL/L 三乙胺涡旋混合震荡,之后加入12.5μl 0.1mol/L PITC涡旋混合震荡室温静置1h,加入100μl 正己烷剧烈混合震荡后静置10min,取下层溶液20μl,加入180μl 流动相A 溶液,混合后0.22μm 过滤处理待测试。3) 高效液相色谱测试:衍生化好的氨基酸衍生物通过岛津高效液相色谱仪LC-20AT 分离检测,相关参数如下:A 液为0.05mol/L 乙酸钠水溶液,B 液为甲醇乙腈水溶液(甲醇:乙腈:水=20:60:20(V:V:V))。流速为:1.0mL/min;柱温:35℃;色谱柱以95%的A 液平衡后,样品由自动进样器上样到氨基酸分析柱。分离梯度为: 0 分钟--- 39 分钟,B液线性梯度从 5 % 到 48 % ; 39 分钟--- 40 分钟,B 液线性梯度从 48 %到 100% ; 40分钟---- 45 分钟,B 液维持在100%,45 分钟---46 分钟,B 液线性梯度从100 %到 5 %,46 分钟---- 60 分钟,B 液维持在5%。4)高效液相色谱数据处理:高效液相色谱LC-20AT 产生的原始数据由仪器自带软件Labsolution 进行手动积分标峰处理,首先对氨基酸混合标准品进行积分标峰并建立外标法对应方法,之后调用建立方法对样品色谱图进行自动积分标峰处理,并得到样品的氨基酸组成摩尔百分比。
样品要求:蛋白纯度>90%,蛋白量>500ug,液体或冻干粉,浓度≥5mg/ml实验原理仪器及方法:本公司cIEF分析在Beckman-Coulter的PA800 plus药物分析系统上进行。在cIEF开始时,整个毛细管里面都充满了样品混合液。样品混合液是两性电解质、稳定剂、pI标准品以及目的蛋白质的混合。在cIEF的分离过程包括两个步骤:聚焦和迁移。毛细管两端分别浸入阳性电解液和阴性电解液中,通入电压后,因为两端有氢离子和氢氧根离子,形成了pH梯度。在聚焦阶段,阴极稳定剂向阴极迁移,而阳极稳定剂向阳极迁移,并且有足量的阴极稳定剂来填充毛细管的出口段,确保两性电解质和蛋白质样品在通过检测窗口前完全聚焦并且在迁移时被检测到。聚焦是双方向的,pH梯度在毛细管两端形成并且向中央迁移,最后阴极和阳极合并。聚焦时间需保证充分以形成完整的pH梯度。形成pH梯度以后,Beckman-Coulter用电压的方法使标准品和待检测样品通过检测窗口。PA800使用乙酸作为化学稳定剂,最大限度的减少了流体动力引起的出峰(检测峰)变宽的现象,增加了检测灵敏度和准确性。样品检测使用280nm光吸收。结果分析使用32Karat软件。
样品要求:蛋白纯度>90%,蛋白量>300ug,液体或冻干粉,浓度≥1mg/ml实验仪器:1) 高效液相色谱仪1200,安捷伦实验试剂:1) 标准品:胰岛素(猪)成分标准物质(GBW09816,中国计量科学研究院)2) 三氟乙酸(T6508,Sigma)3) 乙腈(34851,Sigma)4) 0.22μm 超滤管(8161,Costar)5) C8 反相柱(Agilent,ZORBAX 300SB-C8)37% Acetonitrile Solution(S4B)(014-13831 Wako)实验原理:蛋白质样品通过高效液相色谱分析,结果利用峰面积归一法计算得出度百分比。实验方法:1) 样品处理:样品先用紫外分光光度计测试浓度,然后将样品的pH 值调至3 左右。将样品转移至0.22μm滤膜过滤,12000g 离心5 分钟,之后取样品100μg 上机测试。PVDF膜样品处理:2) 高效液相色谱测试:处理好的样品通过安捷伦高效液相色谱仪1200 分离检测。相关参数如下:A 液为0.1% TFA 水溶液,B 液为0.1%TFA 乙腈溶液。流速为:1.0ml/min;柱温:30℃;色谱柱以3%的B 液平衡后,样品由自动进样器上样进入C8 反相柱(Agilent,ZORBAX 300SB-C8),运行上样程序(3% B 液洗脱维持25 分钟),之后运行洗脱程序,梯度洗脱为70 分钟(A 液从97%~30%,B 液从3%~70%),检测波长为280nm。3) 高效液相色谱数据处理:高效液相色谱仪1200 产生的原始数据由仪器自带软件ChemStationTM进行自动积分标峰处理,并保存。
样品要求:蛋白纯度>90%,蛋白量>200ug,液体或冻干粉,浓度≥1mg/ml实验原理:两性电解质是人工合成的含有多羟基和多羧基的一组同系物,在高压电场的作用下会形成均匀的pH梯度,蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯 度中电泳,泳动到特定的pH位置时便停止,正负电荷相等而呈电中性,从而可将多肽蛋白质根据等电点分离开来并测定其等电点。实验仪器:1) Mμltiphor Ⅱ Electrophoresis System,GE Healthcare; 2) EPS 3501 XL Power Supply,GE-healthcare; 3) PowerLook 2100XL,UMAX 实验试剂:1) 3-10 IEF Standard(161-0310,Bio-Rad) ;2) 2.5-6.5 IEF Standard(17-0472-01,GE) ;3) 两性电解质2-6(4294402,Serva) ;4) 两性电解质3-10(161-1112,Biolyte Ampholyte) ;5) 丙烯酰胺(161-0103,Bio-Rad) ;6) 亚甲基双丙烯酰胺(161-0201,Bio-Rad) ;7) N,N,N',N'-四甲基乙二胺(161-0801,Bio-Rad) ;8) 过硫酸胺(161-0700,Bio-Rad) ;9) 氢氧化钠(10019718,国药集团化学试剂有限公司) ;10)磷酸(10015418,国药集团化学试剂有限公司) 实验方法:1) 样品处理:可对样品进行超滤脱盐处理,根据样品相对分子质量大小,选用适当的超滤管超滤浓缩,再以1%甘氨酸进行置换超滤清洗,重复三次后反超可得测试样品。2)等电聚焦电泳:预电泳:将电极对准电极条中心,加盖,开启外循环冷却系统,将温度设置成15℃。打开电泳电源,将电压设置成700V,电流上限50mA,功率上限为每1cm凝胶1W,开始预电泳,时间为20分钟。正式电泳:预电泳结束后,添加样品和对应的标准品至上样孔,按照电压500V,电流50mA,功率为每1cm凝胶1W的电泳条件,电泳20分钟,之后设置电压2000V,电流50mA,功率为每1cm凝胶1W,再电泳90分钟 。3) 固定染色: 电泳结束后将凝胶支持膜从电泳槽中取出浸入固定液中,至少30分钟后转移到染色液中染色,至少30分钟后再转移到脱色液中脱色,直至凝胶背景清晰。 4) 图像扫描及分析:待凝胶背景清晰后转移至扫描仪进行图像扫描,之后用ImageQuant TL Version 7.0软件分析样品的等电点。
实验技术原理:当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量,基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离,电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即测定离子的质量电荷之比与离子的飞行时间成正比来检测离子。 MALDI-TOF的核心技术就是依据样品的质荷比(m/ z)的不同来进行检测,并测得样品的相对分子质量。本公司使用ABSciex 5800 MALDI-TOF/ TOF对蛋白质相对分子质量进行测试,准确可靠的获得蛋白质相对分子质量信息。MALDI-TOF/TOF是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。正离子检测模式下通常会出现加质子峰([M+1]+)。但当样品分子中含有易与钠离子或钾离子结合的作用位点时,只要极少量的钠离子和钾离子的存在都会导致质谱图中出现加钠峰([M+23]+)和加钾峰( [M+39]+)。实验仪器:5800 MALDI-TOF/TOF(AB Sciex)实验试剂:CHCA(Sigma)、SA(Fluka)、ProteoMass Peptide & Protein MALDI-MS Calibration Kit (Sigma)、样品靶(AB SCIEX)实验方法:点样:μL蛋白样品点至样品靶上,自然干燥后,再取0.6 μL CHCA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥,用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品。校准:在正离子模式下选择反射(线性)方法对样品测试范围进行校准测试。相关参数如下:标准物质校准范围为:反射校准物质校准范围为:1046.542±0.5、1533.858±0.5、2465.199±0.5、3494.651±0.5; 线性标准物质校准范围为:5730.609±50、12362±50、16952±50 测试样品:在正离子模式下选择反射(线性)方法测试样品分子量。 质谱数据及图谱处理:5800 MALDI-TOF/TOF产生的原始数据及图谱由4000 Series Explorer V3.5软件导出。样品要求:蛋白纯度>90%,蛋白量>30ug,液体或冻干粉。